Serological and molecular techniques applied for identification of Plasmodium spp. in blood samples from nonhuman primates / Técnicas sorológicas e moleculares aplicadas na identificação de Plasmodium spp. em amostras de primatas não humanos

Abstract The aim of this study was to identify Plasmodium spp. in blood samples from nonhuman primates (NHPs) in the state of Maranhão, using classical and alternative techniques for examination of human malaria. A total of 161 blood samples from NHPs were analyzed: 141 from captive animals at a Wildlife Screening Center (CETAS) and 20 from free-living animals in a private reserve. The techniques used were microscopy, rapid diagnostic test (RDT), Indirect fluorescent antibody test (IFAT) and molecular techniques (semi-nested PCR, quantitative real-time PCR and LAMP). Two serological methods (dot-ELISA and indirect ELISA) were also standardized with rhoptry protein-soluble antigen of P. falciparum and P. berghei. Trophozoite forms of Plasmodium sp. were identified on slides from five different animals. No samples were positive through RDT and LAMP. Four samples were seropositive for P. malariae through IFAT. The samples showed low reactivity to ELISA. Plasmodium sp. was detected in 34.16% (55/161) of the samples using qPCR based on the 18S rRNA gene. After sequencing, two samples showed 100% identityl to P. malariae, one showed 97% identity to Plasmodium sp. ZOOBH and one showed 99% identity to P. falciparum . PCR was shown to be the most sensitive technique for diagnosing Plasmodium in NHP samples.

Resumo Neste estudo objetivamos identificar Plasmodium spp. em amostras sangue de primatas não humanos (PNH) do estado do Maranhão, utilizando técnicas clássicas e alternativas para o exame da malária humana. Foram analisadas 161 amostras de sangue de PNH, sendo 141 de CETAS (cativeiro) e 20 de reserva particular (vida livre), utilizando microscopia, teste de diagnóstico rápido (RDT), imunofluorescência indireta (IFI) e técnicas moleculares (semi-nested PCR, PCR em tempo real quantitativo e LAMP). Dois métodos sorológicos (dot-ELISA e ELISA indireto) também foram padronizados com antígenos solúveis de roptrias de P. falciparum e P. berghei. Formas trofozoíticas de Plasmodium sp. foram identificadas em lâminas de cinco animais diferentes. Nenhuma amostra foi positiva em TDR e LAMP. Quatro amostras foram soropositivas para P. malariae na IFI. Os soros de PNH mostraram baixa reatividade pelo ELISA indireto. Plasmodium sp. foi detectado em 34,16% (55/161) das amostras utilizando a qPCR baseada no gene 18S rRNA. No sequenciamento, duas amostras mostraram identidade com P. malariae (100%), uma com Plasmodium sp. ZOOBH (97%) e uma com P. falciparum (99%). A PCR mostrou ser a técnica mais sensível para diagnósticos de Plasmodium em amostras de PNH.

Natural Plasmodium infection in neotropical primates in the island of São Luís, state of Maranhão, Brazil / Infecção natural de Plasmodium em primatas neotropicais da Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil

The states that make up the Legal Amazon Region, which include the state of Maranhão, account for 99% of registered cases of human malaria in Brazil. It is also believed that transmission of malaria from nonhuman primates (NHP) to humans occurs in this region, because of current reports of seroepidemiological results from samples from humans and NHP coexisting in the same areas. This study aimed to make morphological, serological and molecular diagnoses of Plasmodium spp. in neotropical primates on the island of São Luís, state of Maranhão, Brazil. The diagnostic techniques used were optical microscopy, the polymerase chain reaction (PCR) and the indirect immunofluorescence assay (IFA). From June 2009 to April 2010, 70 NHP were sampled: 50 at the Wild Animal Screening Center (CETAS), located in the municipality of São Luís and 20 free-living individuals that were caught in a private reserve located in the municipality of São Jose de Ribamar, state of Maranhão. Under an optical microscope, 140 slides (two from each animal) were evaluated and five animals (7.1%) were found to be positive. IFA did not detect anti-Plasmodium spp. From PCR on the 70 animals sampled, amplified Plasmodium spp. products were observed in 13 samples, of which eight (61.5%) were from free-living animals and five (38.5%) were from animals at CETAS.

Os Estados que compõem a Amazônia Legal, entre eles o Estado do Maranhão, respondem a 99% dos casos registrados de malária humana no Brasil. Também se acredita que nessa região ocorra a transmissão de malária de primatas não humanos (PNH) para humanos, devido a relatos atuais de resultados soroepidemiológicos de amostras de humanos e PNH que coexistem nas mesmas áreas. O presente estudo objetivou realizar o diagnóstico morfológico, sorológico e molecular de Plasmodium spp. em primatas neotropicais na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Foram utilizadas como técnicas de diagnóstico: a microscopia de luz, a reação em cadeia pela polimerase (PCR) e a imunofluorescência indireta (RIFI). No período de junho de 2009 a abril de 2010, foram amostrados 70 PNH, sendo 50 provenientes do Centro de Triagem de Animais Silvestres (CETAS), localizado no município de São Luís, e 20 de vida livre, capturados em reserva particular localizada no município de São José de Ribamar, Estado do Maranhão. Foram avaliadas pela microscopia de luz 140 lâminas (duas de cada animal), das quais cinco animais (7,1%) foram positivos. Pela RIFI não se detectou anticorpos anti-Plasmodium spp. Pela PCR, dos 70 animais amostrados, foi possível observar produtos amplificados para Plasmodium spp. em 13 amostras, das quais oito (61,5%) eram de animais de vida livre e cinco (38,5%) de CETAS.